[Note d’Elena Pasca: Voici la deuxième partie de l’exposé du Dr Didier Levieux, à lire en continuité avec la première, parue sur cette page, et avec les autres articles consacrés à divers aspects de l’affaire des héparines chinoises (conflits d’intérêts des experts des autorités sanitaires avec Sanofi-Aventis, au sujet des héparines (Lovenox : énoxaparine) ; le cas du lanceur d’alerte Jacques Poirier ; la pétition et la campagne de soutien organisée par la Fondation Sciences Citoyennes ; une bibliographie très riche pour ceux qui veulent en savoir plus, etc. Retour au texte de Didier Levieux :]
10.3.2 Contrôle de l’héparine en cours de purification (héparine « brute »)
Deux types de contaminants sont recherchés :
1) des contaminants (ADN, protéines) pouvant servir à caractériser l’espèce animale à l’origine de l’héparine
2) le dermatan sulfate et de la chondroïtine persulfatée.
10.3.2.1 Détection de contaminants spécifiques d’espèce :
10.3.2.1.1 Recherche de fragments d’ADN spécifiques d’espèce
Cette recherche s’effectue par PCR (Polymerase Chain Reaction), c’est-à-dire par amplification de séquences d’ADN cibles présentes à l’état de trace. Leur « photocopie » répétée, grâce à des « amorces » et à un système enzymatique (Taq polymérase), multiplie le nombre d’exemplaire jusqu’à ce qu’elles puissent être mises en évidence par migration électrophorétique.
Deux difficultés majeures rendent délicate la PCR dans son application à l’héparine :
– l’ADN est fortement dégradé durant le procédé de purification de l’héparine et cette dégradation dépend du procédé utilisé. La technique a donc été progressivement améliorée chez Sanofi-Aventis par l’amplification de séquences relativement courtes (amplicons de 90 paires de bases) et présentes de façon répétées (ADN satellite).
– l’héparine est un inhibiteur très puissant de la PCR. Pour ne conserver que l’ADN contaminant, différents procédés ont été testés, dont l’extraction de l’héparine.Toutefois, l’élimination complète de l’héparine est difficile, et les analystes de Sanofi-Aventis reconnaissent, en 2008 (Houiste et al, 2008) que dans leurs mains il n’a pas été possible d’obtenir un rendement reproductible. Ils utilisent donc maintenant une autre voie d’approche : la digestion enzymatique de l’héparine (incubation pendant 12 heures avec un mélange d’héparinases I et II). Toutefois, ces enzymes peuvent être inhibées par les glycosaminoglycanes persulfatés ou d’autres substances (Anger, 2010).
La recherche d’ADN pour caractériser l’espèce d’origine a par ailleurs de sérieuses limites :
– les amorces permettant la réalisation de la PCR ne sont pas disponibles dans le commerce ; elles sont la propriété de l’industriel et jalousement gardées. La technique utilisée par un industriel ne peut donc être validée par les autorités dans l’un de ses laboratoires ou pratiquée par d’autres industriels.
– l’ADN n’est pas spécifique de tissu ou d’organe : la contamination par un poil ou une squame cutanée de bovin donnera une réponse positive pour un risque sanitaire nul. D’où des risques de fausses contaminations dans les ateliers qui préparent l’héparine brute et la nécessité de faire les analyses dans des laboratoires hautement spécialisés, protégés de toute contamination inter-échantillons, ou amenée par les techniciens.
– surtout, la recherche d’ADN contaminants ne peut détecter de l’héparine bovine ou ovine que s’il reste, justement, des contaminants. Or, le niveau de contaminants est très variable selon les héparines brutes. Par exemple, leur couleur varie du brun chocolat au blanc plâtre, selon le soin apporté au procédé et à la maîtrise des différentes étapes de la purification. Ainsi une héparine bovine « brute » provenant d’Amérique du Sud, par exemple, peut ne contenir aucun fragment d’ADN. Une héparine « brute », « propre » pourra cependant contenir du prion, car celui-ci est beaucoup plus résistant que l’ADN au procédé de fabrication
Pour pallier à cet écueil, l’industriel valide uniquement les lots d’héparine sur lesquels de l’ADN porcin est trouvé, signifiant ainsi que l’héparine est bien « brute ». On comprendra aisément qu’il suffit d’ajouter une trace d’ADN porcin (quelques soies de porc…) dans une héparine bovine relativement purifiée pour rendre l’échantillon « conforme » : présence d’ADN de porc, donc héparine « brute » propre à la poursuite des analyses, et absence d’ADN de bovin.
10.3.2.1.2 Recherche de protéines spécifiques d’espèce
Des travaux conduits à l’INRA dans le cadre d’un co-financement par Aventis-Pharma, ont mis en évidence une protéine (aprotinine) qui n’existe que chez les bovins. De plus, cette protéine est synthétisée par les mêmes cellules que celles qui synthétisent l’héparine (mastocytes). Enfin, cette protéine de petite taille et résistante aux traitements thermiques, a une charge électrique très positive. De ce fait, elle est libérée de ces cellules étroitement associée à l’héparine (elle-même chargée très négativement), d’où les difficultés rencontrées par les chercheurs pour la caractériser (Rivera et al, 2002a,b). Ces qualités en font une cible parfaite pour dépister l’héparine bovine, et l’équipe INRA a donc développé une technique ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) pour son dosage (Levieux et al, 2001).
Les dosages de type ELISA sont couramment utilisés dans tous les laboratoires d’analyses, en médecine humaine ou vétérinaire. Ils permettent de détecter des anticorps contre dive
rs agents pathogènes ou les agents pathogènes eux-mêmes (bactéries, virus, prion…) ; ils sont également utilisés pour doser des marqueurs biologiques, des hormones, des pesticides, etc. La technique publiée par l’INRA (Levieux et al, 2001a) permet de détecter 5 parties d’intestin de bovin dans 1.000.000 de parties d’intestin de porc.
Les essais comparatifs effectués en 1999 lors de sa mise au point ont montré que cet ELISA était 30 à 300 fois plus sensible que la PCR (selon le type d’amorce utilisé pour la PCR par Aventis-Pharma). La technique est infiniment plus simple que la PCR et non sujette à des contaminations autres que par des cellules mastocytaires de bovins, cellules que l’on trouve majoritairement dans les tissus d’où on extrait l’héparine : intestin et poumon. Elle est donc plus fiable. Aventis-Pharma a néanmoins préféré développer sa PCR en interne, et la technique ELISA n’a donc pas été commercialisée. Elle est quand même appliquée actuellement par la Société IDBiotech sur simple demande de la part des industriels ou des autorités sanitaires.
Dans la même démarche, l’INRA a développé parallèlement des tests ELISA pour détecter les contaminants porcins, ovins et caprins (Levieux et al, 2001b).
Bien entendu, comme pour la recherche d’ADN, la sensibilité de la détection de ces tests ELISA est très dépendante du niveau de purification de l’héparine, et la technique ne pourra jamais déceler une héparine bovine relativement purifiée.
Lire la suite Héparines : production, commercialisation, sécurité des héparines chinoises et risque d’encéphalopathie spongiforme bovine (deuxième partie)
infos générales…
Necrotizing Enterocolitis After Transfusion of Red Blood Cells in Premature Infants
d’une nouvelle étude dont les résultats comprennent certes quelques paradoxes, mais ne sont pas dénués d’intérêt.
refusé de faire vacciner leur enfant annule l’obligation vaccinale contre la poliomyélite inscrite dans la loi belge en 1966. C’était d’ailleurs le seul vaccin obligatoire chez nos voisins belges:
système d’évaluation du médicament après le désastre du Médiator (benfluorex) de Servier, qui n’est qu’un épiphénomène d’une filière médicament biaisée de part en part :
de ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control), publiée le 2 mars :
de deux vaccins : le PREVENAR 7 de Pfizer et l’ACT- HIB de Sanofi-Pasteur, administrés en prévention de certaines formes de pneumonies par streptocoques, de méningites bactériennes et de certaines autres infections provoquées par l’haemophilus influenzae B. (A noter qu’en France comme dans d’autres pays, c’est Wyeth, une filiale de Pfizer, qui commercialise le Prévenar).
vaccins mixtes contre le tétanos, la diphtérie et la coqueluche.
between a journal’s source of revenue and the drug recommendations made in the articles it publishes
Pharmacritique 