Héparines : production, commercialisation, sécurité des héparines chinoises et risque d’encéphalopathie spongiforme bovine (deuxième partie)

[Note d’Elena Pasca: Voici la deuxième partie de l’exposé du Dr Didier Levieux, à lire en continuité avec la première, parue sur cette page, et avec les autres articles consacrés à divers aspects de l’affaire des héparines chinoises (conflits d’intérêts des experts des autorités sanitaires avec Sanofi-Aventis, au sujet des héparines (Lovenox : énoxaparine) ; le cas du lanceur d’alerte Jacques Poirier ; la pétition et la campagne de soutien organisée par la Fondation Sciences Citoyennes ; une bibliographie très riche pour ceux qui veulent en savoir plus, etc. Retour au texte de Didier Levieux :]

 

10.3.2 Contrôle de l’héparine en cours de purification (héparine « brute »)

Deux types de contaminants sont recherchés :

1) des contaminants (ADN, protéines) pouvant servir à caractériser l’espèce animale à l’origine de l’héparine

2) le dermatan sulfate et de la chondroïtine persulfatée.

 

10.3.2.1 Détection de contaminants spécifiques d’espèce :

10.3.2.1.1 Recherche de fragments d’ADN spécifiques d’espèce

Cette recherche s’effectue par PCR (Polymerase Chain Reaction), c’est-à-dire par amplification de séquences d’ADN cibles présentes à l’état de trace. Leur « photocopie » répétée, grâce à des « amorces » et à un système enzymatique (Taq polymérase), multiplie le nombre d’exemplaire jusqu’à ce qu’elles puissent être mises en évidence par migration électrophorétique.

Deux difficultés majeures rendent délicate la PCR dans son application à l’héparine :

– l’ADN est fortement dégradé durant le procédé de purification de l’héparine et cette dégradation dépend du procédé utilisé. La technique a donc été progressivement améliorée chez Sanofi-Aventis par l’amplification de séquences relativement courtes (amplicons de 90 paires de bases) et présentes de façon répétées (ADN satellite).

– l’héparine est un inhibiteur très puissant de la PCR. Pour ne conserver que l’ADN contaminant, différents procédés ont été testés, dont l’extraction de l’héparine.Toutefois, l’élimination complète de l’héparine est difficile, et les analystes de Sanofi-Aventis reconnaissent, en 2008 (Houiste et al, 2008) que dans leurs mains il n’a pas été possible d’obtenir un rendement reproductible. Ils utilisent donc maintenant une autre voie d’approche : la digestion enzymatique de l’héparine (incubation pendant 12 heures avec un mélange d’héparinases I et II). Toutefois, ces enzymes peuvent être inhibées par les glycosaminoglycanes persulfatés ou d’autres substances (Anger, 2010).

La recherche d’ADN pour caractériser l’espèce d’origine a par ailleurs de sérieuses limites :

– les amorces permettant la réalisation de la PCR ne sont pas disponibles dans le commerce ; elles sont la propriété de l’industriel et jalousement gardées. La technique utilisée par un industriel ne peut donc être validée par les autorités dans l’un de ses laboratoires ou pratiquée par d’autres industriels.

– l’ADN n’est pas spécifique de tissu ou d’organe : la contamination par un poil ou une squame cutanée de bovin donnera une réponse positive pour un risque sanitaire nul. D’où des risques de fausses contaminations dans les ateliers qui préparent l’héparine brute et la nécessité de faire les analyses dans des laboratoires hautement spécialisés, protégés de toute contamination inter-échantillons, ou amenée par les techniciens.

– surtout, la recherche d’ADN contaminants ne peut détecter de l’héparine bovine ou ovine que s’il reste, justement, des contaminants. Or, le niveau de contaminants est très variable selon les héparines brutes. Par exemple, leur couleur varie du brun chocolat au blanc plâtre, selon le soin apporté au procédé et à la maîtrise des différentes étapes de la purification. Ainsi une héparine bovine « brute » provenant d’Amérique du Sud, par exemple, peut ne contenir aucun fragment d’ADN. Une héparine « brute », « propre » pourra cependant contenir du prion, car celui-ci est beaucoup plus résistant que l’ADN au procédé de fabrication

Pour pallier à cet écueil, l’industriel valide uniquement les lots d’héparine sur lesquels de l’ADN porcin est trouvé, signifiant ainsi que l’héparine est bien « brute ». On comprendra aisément qu’il suffit d’ajouter une trace d’ADN porcin (quelques soies de porc…) dans une héparine bovine relativement purifiée pour rendre l’échantillon « conforme » : présence d’ADN de porc, donc héparine « brute » propre à la poursuite des analyses, et absence d’ADN de bovin.

10.3.2.1.2 Recherche de protéines spécifiques d’espèce

Des travaux conduits à l’INRA dans le cadre d’un co-financement par Aventis-Pharma, ont mis en évidence une protéine (aprotinine) qui n’existe que chez les bovins. De plus, cette protéine est synthétisée par les mêmes cellules que celles qui synthétisent l’héparine (mastocytes). Enfin, cette protéine de petite taille et résistante aux traitements thermiques, a une charge électrique très positive. De ce fait, elle est libérée de ces cellules étroitement associée à l’héparine (elle-même chargée très négativement), d’où les difficultés rencontrées par les chercheurs pour la caractériser (Rivera et al, 2002a,b). Ces qualités en font une cible parfaite pour dépister l’héparine bovine, et l’équipe INRA a donc développé une technique ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) pour son dosage (Levieux et al, 2001).

Les dosages de type ELISA sont couramment utilisés dans tous les laboratoires d’analyses, en médecine humaine ou vétérinaire. Ils permettent de détecter des anticorps contre dive
rs agents pathogènes ou les agents pathogènes eux-mêmes (bactéries, virus, prion…) ; ils sont également utilisés pour doser des marqueurs biologiques, des hormones, des pesticides, etc. La technique publiée par l’INRA (Levieux et al, 2001a) permet de détecter 5 parties d’intestin de bovin dans 1.000.000 de parties d’intestin de porc.

Les essais comparatifs effectués en 1999 lors de sa mise au point ont montré que cet ELISA était 30 à 300 fois plus sensible que la PCR (selon le type d’amorce utilisé pour la PCR par Aventis-Pharma). La technique est infiniment plus simple que la PCR et non sujette à des contaminations autres que par des cellules mastocytaires de bovins, cellules que l’on trouve majoritairement dans les tissus d’où on extrait l’héparine : intestin et poumon. Elle est donc plus fiable. Aventis-Pharma a néanmoins préféré développer sa PCR en interne, et la technique ELISA n’a donc pas été commercialisée. Elle est quand même appliquée actuellement par la Société IDBiotech sur simple demande de la part des industriels ou des autorités sanitaires.

Dans la même démarche, l’INRA a développé parallèlement des tests ELISA pour détecter les contaminants porcins, ovins et caprins (Levieux et al, 2001b).

Bien entendu, comme pour la recherche d’ADN, la sensibilité de la détection de ces tests ELISA est très dépendante du niveau de purification de l’héparine, et la technique ne pourra jamais déceler une héparine bovine relativement purifiée.

10.3.2.1.3 Recherche du dermatan sulfate et de la chondroïtine persulfatée

En 2008, puis en 2010, la pharmacopée a officialisé la recherche systématique du dermatan sulfate et  des contaminants « oversulfatés » par deux méthodes : la RMN (Résonance Magnétique Nucléaire) et la chromatographie d’échange d’ions (SAX-HPLC : Strong Anionic Exchange High Performance Liquid Chromatography) (J.O. 24 juillet 2008 ; J.O. 28 juillet 2010).

– la RMN du proton (¹H) permet d’obtenir un spectre avec des pics caractéristiques pour l’héparine calcique à 2.05, 3.29, 4.37, 5.35 et 5.43 ppm et pour le dermatan sulfate à 2.08 ppm. Aucun signal ne doit être observé à plus de 4% du signal de l’héparine situé à 5.43, et aucun signal ne doit être observé dans les plages 0.10-2.00, 2.10-3.10 et 5.7-8.00 ppm.

La SAX-HPLC permet de séparer les constituants selon leur charge électrique. Le dermatan sulfate, moins chargé que l’héparine, est élué en premier, suivi de l’héparine puis d’une éventuelle chondroïtine persulfatée.

10.3.3 Contrôle de l’héparine pure

Les contaminants ayant été éliminés par les étapes finales du procédé de purification, c’est sur la molécule d’héparine qu’il faut trouver des différences de structure entre l’héparine porcine et les héparines de ruminants. La structure polysaccharidique de base (colonne vertébrale de l’héparine) étant la même, seules de légères différences dans le nombre et la répartition des groupements sulfates sont observées selon les espèces. L’héparine bovine et, à moindre titre, l’héparine ovine sont légèrement moins sulfatées que la porcine. Toutefois, la sulfatation des unités saccharidiques étant aléatoire, c’est sur une base statistique que se base l’interprétation des analyses, ce qui réduit grandement la sensibilité des méthodes capables de mettre en évidence ces différences de sulfatation.

L’analyse par RMN du proton a montré qu’environ 97% des acides iduroniques des héparines bovines sont sulfatées sur le carbone 2, contre seulement 88% pour les héparines porcines (Casu et al., 1996). Cette analyse permet uniquement de différencier une héparine 100 % bovine d’une héparine 100% porcine. Toutefois, aucun essai n’a été présenté sur des mélanges d’héparine porcine et bovine. Cette technique est donc essentiellement utilisée pour la détection de contaminants comme la chondroïtine persulfatée.

Les analyses par électrophorèse capillaire ou par HPLC d’échange d’ions des disaccharides obtenus par dépolymérisation enzymatique ont également montré des différences inter-espèces de sulfatation ou d’acétylation (Dabat et al., 1993 ; Dabat, 1994 ; Mascellani et al., 1996 ; Bianchini et al., 1997 ; Toida et al., 1997 ; Watt et al., 1997). La SAX-HPLC développée chez Aventis-Pharma dès 1996-1997, puis publiée en 2008, est également basée sur l’analyse des disaccharides obtenus par un clivage (délicat) de l’héparine à l’aide d’enzymes (héparinases I, II et III incubées pendant 48 h). Ces disaccharides sont séparés en fonction de leur pourcentage de sulfatation. La comparaison du rapport de surface entre certains pics caractéristiques (notamment le rapport pic dIIs/dIa) permettrait de détecter, sur des héparines pures, 10% d’héparine bovine et 20% d’héparine ovine, au risque statistique de 5%  (Houiste et al, 2008).

Cette limite de détection semble apparemment satisfaire les responsables pharmaceutiques. Mais un consommateur prendrait-il le risque de se voir injecter de façon répétitive un produit pouvant contenir 10% d’une héparine bovine éventuellement porteuse du nouveau variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob ou 20% d’une héparine ovine provenant de moutons porteurs d’un agent du même type ?

Par ailleurs, le risque statistique d’erreur à 5%, sur lequel est basé le niveau de la sensibilité de la détection, est lui aussi admissible dans une publication scientifique, mais sur le plan industriel il pose un problème de taille : une seule héparine, sur les milliers de lots analysés chaque année, déclarée faussement positive à la détection de matières premières bovines entraînerait le démontage complet des installations industrielles. Il faudrait en effet effectuer une décontamination vis-à-vis d’un éventuel prion (ce qui est quasiment impossible du fait de la résistance de cet agent infectieux aux traitements classiques qui éliminent les virus) ou, plus probablement, reconstruire l’installation. Même un risque à 1 p 1000, qui limiterait la sensibilité à au moins 50% d’héparine bovine dans l’héparine porcine, serait difficilement acceptable en conditions industrielles.

Ceci pourrait expliquer que cette technique n’est pas officialisée par la pharmacopée pour la caractérisation de l’espèce animale ; la SAX-HPLC y est décrite uniquement pour la détection des contaminants « hypersulfatés » comme la chondroïtine persulfatée, avec une dépolymérisation de l’héparine par l’acide nitreux (HNO₂).

Enfin, il ne faut pas oublier deux points importants qui limitent encore l’efficacité d’un contrôle de l’espèce basé sur la structure de l’héparine:

1. selon le procédé de purification utilisé, la sulfatation de l’héparine peut être modifiée ; des héparines porcines d’origines différentes donnent des profils chromatographiques qui s’écartent du profil type, ce qui augmente l’incertitude sur l’analyse ;
2. resulfater légèrement une héparine bovine ou ovine, dans des conditions maîtrisées, pour la rendre indifférenciable de l’héparine porcine, est à la portée de bons chimistes (Maruyama et al, 1998) ; seules des héparines « oversulfatées » par un excès d’agent chimique seront détectées.

Compte tenu des énormes enjeux économiques et du manque criant de matières premières garanties, on peut s’attendre à ce que des « spécialistes » se soient penchés sur la question, et continuent de s’y pencher…

La détection directe du prion n’a pas été évoquée comme moyen de sécurisation efficace, car la sensibilité actuelle des techniques, qu’il s’agisse du Western-Blot ou des ELISAs, n’est pas suffisante pour garantir l’innocuité du produit. Chez les bovins, ces techniques donnent des résultats probants dans la mesure où elles sont appliquées sur le prélèvement d’une zone très préc
ise du cerveau (obex) zone limitée dans laquelle l’agent de l’ESB s’accumule. Dans le cas de l’intestin, la charge en prions est plus faible, et il faut rappeler que ce tissu est infectieux bien avant que les analyses sur le cerveau soient positives.

11. La contamination de l’héparine chinoise par la chondroïtine persulfatée

11.1 Les accidents mortels aux Etats-Unis

Le 7 janvier 2008, le Département de la Santé du Missouri alerte le Center for Disease Control and prevention (CDC) de l’existence de réactions de type allergique survenues à partir du 19 novembre 2007 dans un hôpital pédiatrique. A son tour, le CDC alerte la Food and Drug Administration (FDA) et la Société pharmaceutique Baxter Healthcare Corporation, qui décide de rappeler neuf lots d’héparine. Le 11 février, Baxter annonce l’arrêt de sa production d’héparine, et la FDA lance un avis sanitaire public sur l’existence de graves effets secondaires chez les patients qui ont reçu de fortes doses d’héparine de sodium à partir de flacons multidoses fabriqués par Baxter.

La FDA estime que plus d’un million de flacons multidoses d’héparine sont commercialisés chaque mois aux Etats-Unis, la moitié d’entre eux étant fabriqués et distribués par Baxter. Pratiquement tous les 450 000 patients dialysés chaque année dans ce pays sont traités par l’héparine.

Contrairement aux pratiques appliquées en Europe, aux Etats-Unis le traitement anticoagulant est démarré par l’utilisation de fortes doses d’héparine (5.000 à 50.000 unités) en injection intraveineuse sur une courte période de temps, généralement de l’ordre de quelques minutes. Les effets secondaires graves ont été observés chez les patients qui ont reçu ces fortes doses d’héparine. Ces effets incluaient des réactions allergiques ou de type hypersensibilité, avec des symptômes d’oedème buccal, nausées, vomissements, sudation, détresse respiratoire, ainsi que des cas sévères d’hypotension ayant requis un traitement spécifique. La plupart des accidents se sont produits dans les minutes qui ont suivi l’injection d’héparine, bien que des réactions retardées n’aient pas été exclues. Les cas rapportés concernaient essentiellement l’utilisation de flacons multidoses ; toutefois, il y a eu différents cas d’utilisation combinée de flacons multidoses et unidose pour l’administration d’une dose initiale massive d’héparine. Dès le 1er janvier 2008, 19 décès étaient déjà imputés à l’injection d’héparine.

La FDA a également été informée d’effets secondaires survenus avec d’autres lots que ceux initialement retirés du marché et utilisés chez des patients autres que les hémodialysés. Des cas ont concerné des patients subissant de la chirurgie cardiaque et des irradiations UV des globules blancs (photophérèse).

Le 5 mars 2008, les services officiels de santé des Etats-Unis annonçaient la présence dans l’héparine d’un contaminant non identifié qui pouvait être responsable des décès enregistrés. Ressemblant à l’héparine, il n’a pu être distingué de celle-ci par les analyses de routine. Seules des analyses plus sophistiquées par résonance magnétique nucléaire (RMN) ont pu mettre en évidence la présence de 5 à 20% de ce contaminant, pourcentage variant selon les lots d’héparine incriminés.

Le 29 mars 2008, la FDA annonce que le contaminant de l’héparine Baxter a été identifié comme étant de la chondroïtine sulfate hypersulfatée (Guerini et al, 2008). Dans une conférence de presse, le Dr Janet Woodcock, directrice du Centre FDA d’Evaluation des Médicaments et de la Recherche précise que ce contaminant n’est pas d’origine porcine et que sa structure naturelle a été chimiquement modifiée. De plus, tous les lots d’héparine ayant provoqué des accidents contiennent ce contaminant et tous ont été préparés à partir de matières premières d’origine chinoise dans lesquelles la FDA l’a mis en évidence. Les lots n’ayant pas provoqué d’accidents ne contenaient pas ce contaminant.

11.2 La chondroïtine sulfate, la chondroïtine persulfatée ?

La chondroïtine sulfate est un composant structural naturel important du cartilage auquel il apporte l’essentiel de sa résistance à la compression. Associée à la glucosamine, elle est très utilisée comme complément alimentaire dans le traitement de l’arthrose sous forme de capsules ou de boissons fonctionnelles. Elle est également utilisée en cosmétique dans les crèmes à usage cutané, car elle est capable de retenir jusqu’à trente fois son poids en eau, ce qui lui confère d’excellentes propriétés réhydratantes.

La chondroïtine sulfate est essentiellement extraite à partir de cartilage trachéal de bovins ou de porcs, ou de cartilage de requin, par digestion enzymatique à la papaïne ou à la pepsine (enzymes inefficaces contre le prion de l’ESB). Elle subit ensuite une réduction ménagée par un borohydrure alcalin. Le produit obtenu est constitué d’un large spectre de glycosaminoglycanes qui incluent la chondroïtine-4 et -6 sulfate, le dermatan sulfate, des chondroïtines polysulfatées, de l’héparine et de l’acide hyaluronique.

La chondroïtine extraite du cartilage est une molécule moins sulfatée que l’héparine et, de ce fait, n’a pas de propriétés naturelles anticoagulantes. L’hypersulfatation obtenue par traitement chimique augmente la probabilité d’obtenir des pentasaccharides sulfatés présentant une analogie structurale avec le pentasaccharide de l’héparine qui porte l’activité anticoagulante (Maruyama et al, 1998). Elle est donc difficile à différencier de l’héparine, ce qui explique les problèmes rencontrés par les analystes pour l’identifier comme étant le contaminant de l’héparine Baxter. L’hypersulfatation est une technique déjà utilisée par les producteurs peu scrupuleux pour « porciniser » l’héparine bovine ou ovine. En effet, ces dernières sont légèrement moins sulfatées que l’héparine porcine et l’addition de quelques groupements sulfates les rend quasiment impossible à distinguer de l’héparine porcine.

Selon le journaliste Jake Hooker (2008), les scientifiques qui ont examiné les lots d’héparine Baxter contaminée distribués aux Etats-Unis ont suspecté une addition intentionnelle de la chondroïtine dans l’héparine. Il cite le Dr Jawed Fareed, professeur de Pathologie et de Pharmacologie à l’Université Loyola de Chicago, qui a étudié ces lots d’héparine et a déclaré que « même un enfant vous dirait qu’il s’agit de contrefaçon » ; « il s’agit d’un acte délibéré de
manipulation chimique d’une substance qui ressemble à l’héparine et qui a été mélangée avec elle pour en augmenter le poids« .

En effet, le taux de sulfatation de la chondroïtine sulfate naturelle est compris entre 1 et 1,5, pour 2,5 dans l’héparine. La chondroïtine persulfatée avait un taux de sulfatation de l’ordre de 4,0, ce qui ne se trouve jamais à l’état naturel. Les chimistes fraudeurs ont eu la main lourde sur la sulfatation, c’est ce qui a tué les patients et, par voie de conséquence, a permis de découvrir la fraude. Avec une sulfatation plus « raisonnable », cette fraude serait passée probablement inaperçue pendant de nombreuses années.

La chondroïtine sulfate, disponible comme complément alimentaire, est de 20 à 100 fois moins chère que l’héparine. De nombreuses sociétés chinoises la commercialisent en même temps que l’héparine, ce qui facilite la possibilité de fraude.

11.3 L’origine de l’héparine contaminée : la filière chinoise

Baxter Healthcare Corporation achète l’héparine à un intermédiaire basé dans le Wisconsin, Scientific Protein Laboratories (SPL), qui lui-même s’approvisionne en héparine semi-purifiée auprès de sa filiale chinoise, Changzhou SPL (située au Nord-Ouest de Shangaï), mais également auprès d’autres fournisseurs chinois. Changzhou SPL se fournit lui-même en héparines brutes auprès de deux grossistes qui collectent chacun une douzaine de petits ateliers non contrôlés. SPL est donc incapable de tracer correctement ses approvisionnements.

Le laboratoire d’analyse de l’usine Changzou SPL a utilisé les méthodes analytiques recommandées par la FDA (RMN et électrophorèse capillaire) pour contrôler l’héparine brute qui rentre dans son usine et constaté que le contaminant y était déjà présent. Le contaminant a donc été introduit au niveau des petits ateliers ou, plus probablement, au niveau des grossistes.

Pour compliquer le tableau, Changzhou SPL est enregistré en Chine comme producteur d’ingrédients chimiques et non pas comme industrie pharmaceutique. De ce fait, il ne subit aucun contrôle des autorités sanitaires chinoises. De son côté, la FDA reconnaît publiquement qu’elle a violé son propre règlement de police sanitaire en omettant d’inspecter Changzhou SPL avant que cette Société commence à vendre, dès 2004, de l’héparine à Baxter.

En mars 2008, selon le New York Times, la FDA a inspecté pour la première fois Changzhou SPL et a relevé des défaillances de l’usine dans le contrôle des étapes du process utilisées pour éliminer les impuretés. Elle a relevé également des résultats analytiques en dehors des spécifications et des déficiences dans l’équipement, mais surtout que l’usine acceptait des matières premières provenant de vendeurs inacceptables :

 » It warned that the plant used unclean tanks to make heparin, that it accepted raw materials from an unacceptable vendor and that it had no adequate way to remove impurities » (New York Times, 28 avril 2008).

En avril 2008, selon le même article du New York Times , la FDA aurait identifié douze compagnies chinoises qui ont fourni de l’héparine contaminée à onze pays (Allemagne, Australie, Canada, Chine, Danemark, Etats-Unis, France, Italie, Japon, Nouvelle-Zélande et Pays-Bas). Dans un communiqué en date du 6 mars 2008, la FDA annonce avoir trouvé des pourcentages de chondroïtine allant de 5 à 20% dans les héparines chinoises.

Chez Sanofi-Aventis, onze lots d’énoxaparine contaminés par la chondroïtine persulfatée ont été détectés  et retirés du marché.

Pour la petite histoire, la sulfatation de la chondroïtine n’est pas une invention chinoise. Un journaliste d’investigation, Knut Royce (2008) rapporte que l’invention de la chondroïtine persulfatée a été réalisée, sur du cartilage de trachée de bœuf, par une équipe de l’Iowa dirigée par une sommité de l’héparine, le Pr Linhardt. Selon le pourcentage de O-sulfatation, l’équipe a obtenu, pour cette chondroïtine,  des activés anticoagulantes variables pouvant atteindre celle de l’héparine (activité contre le facteur IIA de l’ordre de 40 unités / mg). Les résultats ont été immédiatement publiés (Maruyama et al, 1998). Après la publication, les chercheurs ont testé leur produit sur des souris… qui sont mortes. Pas de quoi en faire une publication acceptable par une revue scientifique.

N’étant pas au courant de cet effet délétère, l’Université de Shandong, en Chine, a pris par la suite un brevet (20 décembre 2005), pensant pouvoir produire un substitut peu onéreux à l’héparine. Dans les semaines qui suivirent, les chimistes chinois travaillant chez les grossistes ont préparé de la chondroïtine persulfatée à partir de cartilage d’animaux, de peau de requin ou de crustacés. Le produit a ensuite été purifié dans les usines chinoises productrices d’héparine et expédié aux industries pharmaceutiques dans le monde entier. Selon le journaliste, la FDA aurait identifié douze sociétés chinoises différentes impliquées dans cette distribution, mais il n’a pas voulu les citer. L’une d’entre elles était Changzou SPL, la filiale de Scientific Protein Laboratories à Waunakee, dans le Wisconsin, fournisseur direct de Baxter.

11.4 La toxicité de la chondroïtine persulfatée

Un travail réunissant plusieurs équipes a conduit à élucider le mode d’action délétère de la chondroïtine hypersulfatée (Kishimoto et al., 2008). La molécule, extraite à partir des lots incriminés dans les décès de patients aux Etats-Unis, ou préparée en laboratoire, active directement la voie métabolique kinine-kallikréine dans le plasma humain. Cette activation entraîne le clivage protéolytique d’un kininogène de haut poids moléculaire par la kininogénase. Le produit de ce clivage   est la bradykinine, une hormone peptidique (nonapeptide) qui est un puissant médiateur actif sur les muscles lisses et sur les vaisseaux sanguins qu’il dilate, augmentant ainsi leur perméabilité. Dans la circulation pulmonaire, la bradykinine a au contraire un effet constricteur. Cette action est comparable à celle de l’histamine et expliquerait le choc circulatoire induit par certains venins et toxines.

La chondroïtine persulfatée induit de plus la formation in vitro des composants C3a et C5a, qui sont de puissantes anaphylatoxines dérivées de la cascade des protéines du Système du Complément. L’activation de ces deux voies résulte, de façon inattendue, de l’activation du facteur XII. Les auteurs ont démontré qu’elle est effective aussi bien chez l’homme que chez le porc, provoquant une forte réaction hypotensive.

Ces résultats ont été ensuite confirmés par une équipe dirigée par Linhardt (Li et al, 2009) qui a précisé notamment le mode d’action anticoagulant de la chondroïtine persulfatée en utilisant la résonance plasmonique de surface. Cette molécule n’entraîne pas, comme l’héparine, le changement conformationnel de l’antithrombine III nécessaire à l’inactivation de la thrombine et du facteur Xa. Au contraire, elle se lie fermement au facteur XIIa, ce qui suggère la possibilité du déclenchement de la production de bradykinine par le facteur XXa.

Le résultat final : aux Etats-Unis, 81 patients sont décédés d’un choc hypotensif « anaphylactoïde ».

12. Aux Etats-Unis, la Chambre des Représentants s’inquiète

Dans un courrier en date du 29 août 2010 adressé à Margaret Hamburg, Directrice de la FDA, deux membres de la Chambre des Représentants, rapporteurs à la Commission de l’Energie et du Commerce du Congrès des Etats-Unis (Barton & Burgess, 2010) rappellent que :

• l’affaire de la chondroïtine persulfatée n’est toujours pas résolue ;
• cette contamination est, parmi les approvisionnements en médicaments, la plus importante et la plus longue connue ;
• tous les éléments convergent vers une contamination faite, en Chine, par la main de l’homme, et qu’il s’agit donc d’un crime ;
• la FDA a mis en exergue, dans sa conférence du 22 juin 2010, l’augmentation de la prévalence des médicaments contrefaits en Chine ;

• malgré les précautions prises pour éviter la contamination de l’héparine par la chondroïtine persulfatée, des risques significatifs sur la sécurité des héparines persistent du fait de la possibilité – 1) de fournisseurs non autorisés ou non contrôlés ; – 2) de la contamination de l’héparine brute par des matières premières d’origine autre que porcine ; – 3) de la contamination de l’héparine par des substances chimiques ;
• la pression de la demande en héparine est telle que des risques de contamination volontaire doivent être pris en considération. Selon un journal coréen, une épidémie de fièvre aphteuse sévirait sur les porcs chinois, causant un risque de rupture d’approvisionnement en héparine et une augmentation des prix. Autrement dit, des conditions analogues à celles de 2006-2007, qui pourraient entraîner des tentatives de contamination avec des substances dangereuses autres que la chondroïtine.
• le gouvernement chinois bloque les enquêtes sur les personnes responsables de la contamination par la chondroïtine (refus de visa pour les enquêteurs américains).

13. Où en est-on aujourd’hui ? Une évolution inquiétante de la Pharmacopée européenne et française

La monographie de la Pharmacopée Européenne concernant les héparines calciques et sodées ainsi que la Pharmacopée des Etats-Unis spécifiaient jusqu’en 2008 que l’héparine devait être exclusivement obtenues à partir de la muqueuse intestinale porcine. L’arrêté du ministre de la Santé et des Sports en date du 24 juillet 2008 (J.O.R.F. 2008) apporte des modifications qui sont résumées dans un document de l’AFFSAPS (AFFSAPS 2008) intitulé « Compte rendu de l’assemblée plénière de la Commission nationale de la pharmacopée » (réunion du mardi 4 novembre 2008). A la page 14, on peut lire ceci :

« Quatre modifications ont été introduites dans la rubrique PRODUCTION des monographies :

• a) Utilisation possible d’héparine d’une des 4 origines suivantes sans mélange : poumon de boeuf, muqueuse intestinale de porc, muqueuse intestinale de boeuf, muqueuse intestinale de mouton.
• b) Mise en place d’un système d’assurance de la qualité approprié.
• c) Mise en oeuvre de méthodes de production permettant d’assurer l’absence de contamination par des glycosaminoglycanes persulfatés.
• d) Mise en oeuvre des techniques de RMN du proton et d’électrophorèse capillaire sous la responsabilité de l’Autorité compétente« .

Plus récemment, une remise à jour de la Pharmacopée européenne concernant les héparines calciques et sodées a été publiée en août 2010 et reprise mot pour mot dans la Pharmacopée française par un nouvel arrêté du ministère de la Santé (J.O.R.F. 2010). Elle introduit l’utilisation possible des différents tissus et espèces dans la DEFINITION  des héparines :

« L’héparine calcique peut être préparée soit à partir de poumon de boeuf, soit à partir de muqueuse intestinale, soit de porc, soit de boeuf, soit de mouton.« 

Cette monographie officialise de plus les techniques RMN et la SAX-HPLC  pour l' »IDENTIFICATION » du produit, les conditions opératoires étant décrites en détail. Dans la partie « PRODUCTION », la monographie précise :

« Toutes les étapes de la production et de l’approvisionnement sont soumises à l’application d’un système de management de la qualité approprié. L’identité de l’espèce source et l’absence de matériel provenant des autres espèces sont vérifiées lors de la production, au moyen d’essais appropriés« .

Aucune précision supplémentaire n’est donnée sur ces essais : à quel stade du p
rocédé, quelle technique, quelle sensibilité…? Heureusement, à la rubrique « ETIQUETAGE » il est précisé : « L’étiquette indique….l’espèce animale d’origine. » Ce qui devrait rassurer le consommateur…

Comment comprendre que la Pharmacopée ouvre la possibilité de fabriquer de l’héparine avec de l’intestin de bovin quand :

• les préparations magistrales à base de tissus d’origine bovine sont interdites en France depuis 1992 ;
• l’intestin de bovin est toujours classé « Matériau à Risque Spécifié », donc interdit à la vente et obligatoirement incinéré ;
• les matières premières d’origine chinoise qui dominent le marché sont si peu fiables ;
• nos méthodes de contrôle de l’origine animale sont si peu appliquées sur la matière première princeps (intestin) ou si peu efficaces sur les héparines brutes ou pures ?

La pharmacopée américaine revue en septembre – octobre 2009 est plus restrictive dans sa DEFINITION des héparines que la Pharmacopée européenne ; elle spécifie en effet que l’obtention de matière première doit être effectuée en accord avec la réglementation d’usage :

« The sourcing of heparin material must be specified in compliance with applicable regulatory requirements«  (Pharmacopeial Forum, 2009).

Il est par ailleurs étonnant de voir apparaître dans la littérature de nouvelles publications sur l’activité biologique des héparines bovines ainsi que des essais cliniques (voir les références « Essais cliniques décembre 2009 ») réalisés au Brésil comparant les héparines bovines et porcines. Encore plus symptomatique est la tenue récente d’un Workshop à Londres, en juillet 2010, auquel étaient présents tous les principaux producteurs d’héparine et qui a fait la part belle aux héparines bovines.

Le Pr Giuseppe Mascellani (Mascellani 2010) a ainsi insisté sur l’augmentation importante du prix des héparines porcines brutes (7 € par mega unité en 2007, 11 € en 2008, 28 € en 2009 et 60 en juin 2010) et les difficultés d’approvisionnement pour réclamer l’inclusion de l’héparine bovine dans les monographies :

« Shortage and high selling prices of pig mucosa heparin suggest collecting data in order to ask EDQM the inclusion of a new monograph regulating the use of the not new beef mucosa heparin ».

« Not new beef mucosa heparin« … En effet, l’Italie a été longtemps un gros producteur d’héparine bovine et a dû arrêter à contrecoeur sa production à cause de l’ESB.

Le Pr Mascellani a cependant reconnu que la « Beef mucosa heparin differs from pig mucosa heparin in structure and activities« , un sujet repris par le Pr Paolo Mourao (Mourao, 2010) de l’Université de Rio de Janeiro (le Brésil est actuellement le seul grand producteur officiel d’héparine bovine). Ce dernier a exposé que les héparines extraites de muqueuse bovine et porcine diffèrent dans leurs propriétés anticoagulantes, dans leur tendance à provoquer des hémorragies, dans la posologie requise pour inhiber une thrombose expérimentale et dans les courbes d’inhibition par la protamine. Sa conclusion : « We suggest that these two heparins are not equivalent drugs » est confortée par les travaux de Francis et coll. (2003), qui montrent une réaction immunitaire de l’organisme (synthèse d’anticorps) plus importante contre l’héparine bovine que contre l’héparine porcine lors de pontages coronariens.

La pression au niveau de la Pharmacopée des industriels producteurs d’héparine d’origine animale, par ailleurs membres des Commissions de la Pharmacopée, s’est donc révélée efficace : l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé (AFSSAPS) leur reconnaît maintenant la possibilité d’utiliser des matières premières qui ne peuvent être réellement garanties en terme de sécurité vis-à-vis du prion. C’était en fait leur seule possibilité de ne pas freiner la croissance de leurs ventes d’héparines non fractionnées et d’HBPM.

N’était-ce pas le même problème de pénurie en matières premières qui a conduit l’Institut Pasteur à étendre son approvisionnement en hypophyses auprès de sources « douteuses » (filière bulgare) pour produire une hormone de croissance contaminée par le prion, avec les conséquences que l’on sait et que l’actualité nous rappelle ? Les responsables ont argué que le risque de transmettre le prion leur était alors inconnu. Le Pr Luc Montagnier, membre de l’Institut Pasteur, a pourtant affirmé avoir mis en garde l’Association de Jean-Claude Job (France Hypophyse) contre l’utilisation du cerveau d’une personne morte d’encéphalite aiguë, de tumeur intracrânienne ou de maladie chronique du système nerveux. En 1984, en Californie, un jeune homme de 21 ans meurt de la maladie de Creutzfeldt-Jakob après avoir suivi un traitement à l’hormone de croissance extractive dans les années 1970. L’autopsie est formelle: il y a un lien entre la MCJ et l’hormone. Cela n’a pourtant pas conduit le laboratoire de l’Institut Pasteur à une meilleure sécurisation ou à l’abandon de la production d’hormones de croissance d’origine hypophysaire (ce qu’ont fait les Etats-Unis dès 1985). Il y avait trop d’enjeux financiers. La Cour d’Appel de Paris a les mois d’octobre et novembre 2010 pour apprécier…

Ce qui est sûr, c’est qu’aujourd’hui on sait très bien quel est le risque de jouer avec le prion. Malheureusement, dans le cas de l’héparine, le marché des matières premières dépasse largement les frontières de la Bulgarie et la puissance des industriels concernés ainsi que les enjeux financiers sont sans commune mesure avec ceux de l’hormone de croissance.

Didier LEVIEUX

Docteur Vétérinaire, Directeur de Recherches Honoraire INRA, consultant scientifique.

Déclaration d’intérêts : Néant.

Copyright Didier Levieux, Pharmacritique

 

Références bibliographiques

AFSSAPS 2008 Commission nationale de Pharmacopée. Assemblée plénière du mardi 4 novembre.

Aguzzi A, 2002. Prion pathogenesis : a journey through gut, spleen and nerves. Second International TSE Diagnostic Meeting, Paris, November 14.

Anger P, 2010. New developments in qPCR applied to heparin quality control. 4th Workshop on Heparin, London July 8/9.

Barbosa D, Bodganich W, 2008. New York Times  28 February.

Barton J, Burgess M., 2010. Letter to Margaret Hamburg, FDA, July 22.

Benoit Browaeys D, 2005, Anticoagulants : la filière chinoise. 60 millions de consommateurs, N. 399, pp. 20-23.

Bianchini P, Liverani L, Mascellani G and Parma B, 1997. Heterogeneity of unfractionated heparins studied in connection with species, source, and production processes. Semin. Thromb. Hemost., 23, 3-10.

Brugère-Picoux J, 2002. TSEs epidemiology and surveillance, Meet-the-expert session, Second International TSE Diagnostic Meeting, Paris, November 14.

Camussi G, Battaglia E, Lupia E and Montrucchio G, 1996. Modulatory role of heparin and heparan sulfates on angiogenesis ; in : Nonanticoagulant actions of Glycosaminoglycans. Harenberg J. et Casu B. (eds). Plenum Press, New York and London, pp 201-208.

Casu B, Moretti M, Oreste P, Riva A, Torri G, Vercellotti JR, 1980. Glycosaminoglycans from pig duodenum. Arzeim. Forsch., 30, 1889-1892.

Casu B, Guerrini M, Naggi A, Torri G, De-Ambrosi L, Boveri G, Gonella S, Cedro A, Ferro L, Lanzarotti E., Paterno M, Attolini M, Valle MG, 1996. Characterization and sulfation patterns of beef and pig mucosal heparins by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Arzeim. Forsch., 46, 472-477.

Choay J, 1989. Structure and activity of heparin and its fragments : an overview. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 15 (4), 359-364.

CE 2002 Règlement n° 1774/2002  du Parlement européen et du Conseil du 3 octobre 2002 établissant des règles sanitaires applicables aux sous-produits animaux non destinés à la consommation humaine. JO L 273 du 10.10.2002.

Conseil de l’union Européenne 2001. Conclusions du Conseil du 5 juin 2001 sur la situation épidémiologique du variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (v-MCJ) et sur une stratégie anticipatoire en matière de zoonoses, notamment en ce qui concerne les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST).

Cornelli U, 1996. Non-anticoagulant actions of glycosaminoglycans. The therapeutical approach to Alzheimer’s disease. In : Nonanticoagulant actions of Glycosaminoglycans. Harenberg J. et Casu B. (eds). Plenum Press, New York and London, pp 249-280.

Coyne E, 1981. Heparin – Past, Present and Future. In : Chemistry and Biology of Heparin. Lundblad R.L., Brown W.V., Mann K.G. et Robert H.R. (eds). Elsevier North Holland, Inc. pp 9-17.

Dabat ., Espejo JM, Branellec JF, Damm J, Deksen M, van Dedem G, 1993. Identification of the animal species of origin of purified heparins by enzymatic degradation and quantitative analysis of the dgradation prducts. ISTH, New-York.

Dabat M, 1994. Etude des différences de structure entre des héparines d’origines animales diverses par électrophorèse capillaire et chromatographie d’échange d’ions. Thèse de doctorat en Biologie Cellulaire ; Université de Rouen. 225 p.

Duclos JP, 1984. L’héparine, fabrication, structure, propriétés, analyses. Paris, Ed. Masson, 399 p.

Ekre HP., Naparstek Y, Lider O, Hydén P, Hägermark Ö, Nilsson T, Vlodavsky I, Cohen I, 1992. Anti-inflammatory effects of heparin and its derivatives, inhibition of complement and of lymphocyte migration. In : Heparin and Related Polysaccharides, Lane D.A. Björk I. et Lindahl U. (eds). Plenum Press, New York, pp 329-340.

EMEA, 1996. The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products – Human Medecines Evaluation Unit. Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP). Note for guidance on minimising the risk of transmitting animal spongiform encephalopathy agents via medicinal products. CPMP/BWP/877/96

EMEA, 1998. The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products – Human Medecines Evaluation Unit. Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP). Note for guidance on minimising the risk of transmitting animal spongiform encephalopathy agents via medicinal products. CPMP/BWP/1230/98

EMEA, 2000. The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products – Human Medecines Evaluation Unit. Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP). Note for guidance on minimising the risk of transmitting animal spongiform encephalopathy agents via medicinal products. CPMP/BWP/1230/98 rev. 1.

Essais cliniques héparine bovine : http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NTC01034488?intr= »bovine »&rank=19

http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NTC01072955?intr= »bovine »&rank=35

Fairclough G, Burton T 2008, Wall Street Journal 21 February.

Foster JD, Hope J, Fraser H, 1993. Transmission of bovine spongiform encephalopathy to sheep and goats. Vet. Rec., 133, 339-34.

Francis JL, Palmer GJ Moroose R, Drexler A, 2003. Comparison of Bovine and Porcine Heparin in Heparin Antibody Formation After Cardiac Surgery. Ann Thorac Surg, 75, 17-22.

Griffin CC, Linhardt RJ, Van Gorp CL, Toida T, Hileman R E, Schubert R, Brown SE, 1995. Isolation and characterisation of heparan sulfate from crude porcine intestinal mucosal peptidoglycan heparin. Carbohydr. Res., 276, 183-197.

GSK Ventes 2009, Press release.

Guerrini  M, Beccati D, Shriver Z et al, 2008. Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events. Nature Biotechnology, 23 April.

Holodniy M, Kim S, Katzenstein, Konrad M, Groves E, Merigan TC, 1991. Inhibition of human immunodeficiency virus gene amplification by heparin. Journal of Clinical Microbiology, 29, 676-679 (Advanced online publication).

Hooker J, 2008, New York Times, 19 March.

Houiste C, Auguste C, Macrez C, Dereux S, Derouet A Anger P, 2008. Quantitaive PCR and disaccharide profiling to characterize the animal origin of low-molecular-wieight heparins. Clin Appl Thromb Hemost,  Sept 2008.

Jackson RL, Busch SJ, Cardin AD, 1991. Glycosaminoglycans : molecular properties, protein interactions, and role in physiological processes. Physiological Reviews, 71 (2), 481-539.

J.O. République française, 11 juillet 2000. Arrêté du 10 juillet 2000 relatif à l’interdiction d’importation de certains tissus de bovins à risques au regard des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles NOR: AGRG0001126A.

J.O. République française, 27 juillet 2008. Arrêté du 24 juillet 2008 portant additif n°81 à la Pharmacopée NOR : SJSP0818407A.

J.O. République française, 28 juillet 2010. Arrêté du 20 juint 2010 portant additif n°90 à la Pharmacopée NOR : SASP1019837A.

Kessler C., 1997. Low molecular weight heparins : practical considerations. Seminars in Hematology, 34, 35-42.

Kirchhoffer  R, Lachkar P, Lampetaz R, Lloret S, Voillot H, 29 janvier 2009. Rapport ESSEC. La Chine et ses exportations. Les incidents portant sur la qualité des produits exportés par la Chine.

Kishimoto TK, Viswanathan K, Ganguly T, Elankumaran S, Smith S, Pelzer K, Lansing JC, Sriranganathan N, Zhao G, Galcheva-Gargova Z, Al-Hakim A, Bailey GS, Fraser B, Roy S, Rogers-Cotrone T, Buhse L, Whary M, Fox J, Nasr M, Dal Pan GJ, Shriver Z, Langer RS, Venkataraman G, Austen KF, Woodcock J, Sasisekharan R. 2008. Contaminated Heparin Associated with Adverse Clinical Events and Activation of the Contact System. N Engl J Med, 358, 2457-2467.

Knight R, 2002. Surveillance and Epidemiology of TSEs : The current vCJD situation. Second International TSE Diagnostic Meeting, Paris, November 14.

Knut R, 2008. FDA failures contribute to spread of contaminated drugs

http://worldfocus.org/blog/2008/12/17/fda-failures-contribute-to-spread-of-contaminated-drugs/3287/

Levieux D, Levieux A, 2001. Immunochemical control of the species origin of intestinal mucosa used for heparin purification. J. Immunoassay 22, 127-145.

Levieux A, Rivera V,Levieux D, 2001a. A sensitive ELISA for the detection of bovine crude heparin in porcine heparin. J. Immunoassay Immunochem. 22, 323-336.

Levieux A, Rivera V, Levieux D, 2001b. Immunochemical control of the species origin of porcine crude heparin and detection of ovine and caprine materials. J. Pharm. Biomed. Anal. 27, 305-313.

Li B,Suwan J, Martin JG, Zhang F, Zhang Z, Hoppensteadt D, Clark M, Fareed J, Linhardt RJ, 2009. Oversulfated chondroitin sulfate interaction with heparin-binding proteins: New insights into adverse reactions from contaminated heparins. Biochem Pharmacol. 2009 August 1; 78(3): 292–300.

Lindahl U, 1969. Comment on the use of cetylpyridinium chloride in the isolation of connective-tissue proteoglycan. Biochem. J., 113, 569-570.

Linhardt RJ, Wang HM and Ampofo SA, 1992. New methodologies in heparin structure analysis and the generation of LMW heparins. In : Heparin and Related Polysaccharides, Lane D.A. Björk I. et Lindahl U. (eds). Plenum Press, New York, pp 37-47.

Maruyama T, Toida T, Imanari T, Yu G, Linhardt RJ, 1998 Conformational changes and anticoagulant activity of chondroitin sulfate following its O-sulfonation. Carbohydr Res., 306(1-2):35-43.

Mascellani G, 2010.Heparin: shortage and high selling prices. Should bee
f mucosa heparin be reconsidered? 4th Workshop on Heparin London July 8/9.

Mascellani G, Liverani L, Bianchini P, 1996. Analysis of heparin origin by HPLC quantitation of disaccharide components. Il Farmaco, 51, 247-254.

McLaurin J, Franklin T, Kuhns W, Fraser PE, 1999. A sulfated proteoglycan aggregation factor mediates amyloid-beta peptide fibril formation and neurotoxicity. Amyloid, 6, 233-243.

Merchant ZM, Erbe EE, Eddy WP, Patel D, Linhardt RJ, 1986. Effect of very low molecular weight heparin-derived oligosaccharides on lipoprotein lipase release in rabbits. Atherosclerosis, 62, 151-158.

Mourao PA, 2010. Structural and functional differences between bovine and porcine mucosal heparins. 4th Workshop on Heparin London July 8/9.

MRS1 Définition des MRS http://esbinfo.agriculture.gouv.fr/article.php3?id_article=13&var_re

MRS2 Liste des MRS http://esbinfo.agriculture.gouv.fr/article.php3?id_article=36&var_recherche=liste+MRS

Nader HB andDietrich CP, 1989. Natural occurrence and possible biological role of heparin. In : Heparin. Chemical and biological properties, clinical applications. Lane D.A. et Lindahl U. (eds). London, Edward Arnold. pp 81-96.

NSD Bio Group, April 2010. Pharma Report. Potential Health & Safety Impacts from Pharmaceuticals and Supplements Containing Chinese-Sourced Raw Ingredients.

Petersen M, Wineter G, 2001. 5 Drug makers Use Material With possible Mad Cow Link. New-York Times Feb, 8. (www.nytimes.com/2001/02/08/health/08cow.html)

Petitou M, Lormeau JC, Choay J, 1991. Chemical synthesis of glycosaminoglycans : new approaches to antithrombotic drugs. Nature, 350, 30-33.

Pharmacopeial Forum 35(5) Sept.-Oct 2009. Change to read: Heparin sodium.

Rivera V, Levieux A, Levieux, 2002a. Immunochemical characterization of species specific antigens in bovine crude heparins. J. Pharm. Biomed. Anal., 29, 431-441

Rivera V, Levieux A, Levieux D, 2002b. Characterization of Ag1, the major species specific contaminant of bovine crude heparin, and identification as an aprotinin/heparin complex. J. Pharm. Biomed. Anal. 29, 443-458.

Sanofi Aventis, Rapport financier sémestriel 2010.

Scott JE, 1960, Aliphatic ammonium salts in the assay of acidic polysaccharides from tissues. In : Methods of Biochemical Analysis. Volume VIII. Glick D.(eds), Interscience Publishers, Inc. New York. pp 145-197.

Spear PG, Shieh MT, Herold BC, Wudunn D, Koshy TI, 1992. Heparan sulfate glycosaminoglycans as primary cell surface receptors for herpes simplex virus. In : Heparin and Related Polysaccharides, Lane DA, Björk I, Lindahl U (eds). Plenum Press, New York, pp 341-353.

Spraker T, 2002. Chronic Wasting Disease in Mule-Deer and Elk in Colorado. Second International TSE Diagnostic Meeting, Paris, November 14.

S.S.C. 2002. Complement to the Scientific Steering Committee opinion of 4-5 April 2002 on safe sourcing of small ruminant materials, with special reference to the safety with regard to BSE risks of sheep intestine and casings. European Commission, Health and Consumer Protection Directorate-General. Meeting of 12-13 September 2002.

Toida T, Huang Y, Washio Y, Maruyama T, Toyoda H, Imanari T, Linhardt RJ, 1997. Chemical microdetermination of heparin in plasma. Anal. Biochem. 251, 219-226.

University of California, San-Francisco, 2002. Communiqué du 21/10/2002. (http://www.sciencedaily.com /releases/2002/10/021021051415.htm)

Volpi N, 1993. Extraction, purification and evaluation of structures and physico-chemical properties of glycosaminoglycans. Boll. Chim. Farmaceutico, 132, 153-160.

Wang Y, 2010 Challenges in Sourcing Chinese Crude Heparin. 4th Workshop on Heparin London July 8/9.

Watt DK, Yorke SC, Slim GC, 1997. Comparison of ovine, bovine and porcine heparins and low molecular weight heparins by disaccharide analysis and 13C NMR. Carbohydr. Polymers, 33, 5-11.

WHO; 1991. World Health Organisation. Report of a WHO consultation on public health issues related to animal and human spongiform encephalopathies. WHO/CDS/VPH/92.104 (12-14 Nov.)